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瓊脂糖-重組大消化鏈球菌蛋白L親和填料大消化鏈球菌蛋白L（PPL）能與抗體的κ輕鏈結合而不會影響抗體的抗原結合位點，這一特性使其與結合抗體Fc區域的蛋白A、蛋白G相比，能更廣泛地結合各種來源及亞類的抗體。如人類的IgG、IgM、IgA、IgE、IgD，以及含κ輕鏈（人類1、3、4型，小鼠1型）的Fab、scFv 等抗體片段。
產品型號：廠商性質：生產廠家更新時間：2024-10-13訪 問 量：1289
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瓊脂糖-重組大消化鏈球菌蛋白L親和填料
1. 產品介紹
（Recombinant Peptostreptococcus magnus Protein L，簡稱r-PPL、蛋白L）偶聯在高度交聯的瓊脂糖凝膠上的一種親和純化介質。大消化鏈球菌蛋白L（PPL）能與抗體的κ輕鏈結合而不會影響抗體的抗原結合位點，這一特性使其與結合抗體Fc區域的蛋白A、蛋白G相比，能更廣泛地結合各種來源及亞類的抗體。如人類的IgG、IgM、IgA、IgE、IgD，以及含κ輕鏈（人類1、3、4型，小鼠1型）的Fab、scFv 等抗體片段。但不能與重鏈、λ輕鏈、κ輕鏈（2型）結合，因而本產品不能純化牛、山羊、綿羊、雞來源的抗體。
2 、產品特點與技術指標
產品名稱 | 瓊脂糖-重組大消化鏈球菌蛋白L親和填料 |
基質 | 4%交聯瓊脂糖 |
配基 | 重組大消化鏈球菌蛋白 L ， ≥6mg/mL |
粒徑范圍 a | 45~165 μm |
平均粒徑 | ~90 μm |
動態結合載量 b | ≥40 mg κ 輕鏈 h-IgG/mL |
推薦工作流速 c | 60~300 cm/h |
最大流速與壓力 d | >900 cm/h |
使用 pH | 2~9（推薦的工作 pH），15 mM NaOH（CIP） |
化學穩定性 | 在以下溶液中穩定：常用的水相緩沖液；6 mol/L 鹽酸胍；70% 乙醇。 |
儲存與運輸 | 20%乙醇，2~8 ℃保存，2~30 ℃運輸 |
注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍；bDBC10%測試條件為：10%流穿，6 min 停留時間；c 推薦流速是指該流速可滿足大部分柱高下2~6 min 停留時間的使用條件，并非只能在該流速范圍內工作；d 10 cm 柱高下的最大測試流速。
3、 不同配基與抗體的結合力
蛋白L與蛋白A、蛋白G對各類抗體的親和力差異如下表所示。
注：-表示不結合；+表示微弱結合；++表示中等結合；+++表示很強結合；NA表示暫無數據。能用于親和純化的抗體一般需要中等以上的結合力。
4 、使用方法參考
4.1 色譜柱裝填
以下闡述與層析系統連接時，填料的色譜柱裝填方法。
（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理。
（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩定體積。ProLNUPharoseFF的壓縮比為1.15。為使達到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。
（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應體積，抽濾除去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復3次，以除去保存液。也有用20%乙醇+0.4M NaCl作為裝柱液的應用案例。
（4）裝柱填料懸液準備：將填料轉移到適當的容器中，加入適量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。
（5）裝填前準備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下 端的空氣，在柱內保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調整柱子使其垂直于地面。
（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內（必要時使用裝柱器），為避免引入氣泡，應使之沿層析柱內壁自然流下。將所有填料加入后，用裝柱液將裝柱器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統連接。
（7）壓柱：使柱內填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續壓柱至界面清晰穩定，標記界面穩定時的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標記位置下方與壓縮比對應的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內的填料。
裝柱條件 | ProLNUPharose FF |
壓縮比 | 1.15 |
裝柱流速 | 300~600 cm/h |
4.2 柱效測定和評價
完成裝柱后、使用前可通過柱效測定和評價可以確認層析柱裝填質量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價。柱效測定可以采用丙酮或者NaCl作為樣品進行，按照下表配制樣品溶液和流動相。
樣品 | 1.0%丙酮 | 0.8~1.0 M NaCl |
樣品體積 | 1.0%柱體積 | 1.0%柱體積 |
流動相 | 純水 | 0.4 M NaCl |
流速 | 30 cm/h | 30 cm/h |
檢測器 | UV-280nm | 電導 |
根據UV 或者電導率曲線計算理論塔板高度（HETP）、理論塔板數（N）和非對稱因子（As），公式如下：
HETP=L/N
N=5.54(VR/Wh)2 As=a/b
其中：L為柱高；VR為保留體積；Wh為半高峰寬；a為在10%峰高處的第一個半峰寬；b為在10%峰高處的第二個半峰寬。
一般來說，HETP的數值應小于填料平均粒徑的三倍（即HETP/D50<3，D50為填料的平均粒徑），As應在0.8~1.5之間。
4.3 平衡與上樣（Equilibration & Loading）
PB緩沖液（20 mM PB+150 mM NaCl，pH=7.0~7.4）是較為常用和通用的緩沖體系。初始的緩沖液稱為平衡緩沖液，記為緩沖液A。
在上樣前，需用緩沖液A在操作流速下平衡層析柱，該過程通常需要5~10個柱體積的緩沖液A，以電導、pH等檢測信號參數不變且與緩沖液A對應為準。
上樣量可按“mg 目標蛋白/mL填料"來設定，通常為DBC10%的50~80%，例如ProL NUPharose FF產品對人IgG的DBC10%為~40mg/mL，上樣量可控制為20~32mg/mL。在條件篩選階段，也可以降低上樣品，觀察結合、特異性和洗脫情況。上樣前需要對樣品進行離心（10000 g 以上）、過（0.22或0.45μm）處理，以免堵塞色譜柱。
上樣后需要3~10個柱體積的緩沖液A再平衡層析柱。
4.4 洗脫與再生（Elution & Regeneration）
最-常用的洗脫方式為pH=2.5~3.0的甘-氨酸、檸檬酸鹽或乙酸鹽，該條件可基本將抗體完-全洗脫。但該pH較低，可能會使一些抗體失活或聚集，在條件篩選階段可逐步降低pH，篩選出收率可接受、抗體不失活或不聚焦的最高pH。也可以將洗脫液收集在弱堿性的緩沖液中，中和至中性，以縮短低pH條件的接觸時間。洗脫之后，可用 5~10個柱體積的洗脫液對色譜柱進行再生。
4.5 在位清洗（CIP）
ProLNUPharose FF可耐受15 mM NaOH的CIP過程（至少2個柱體積，10~30 min的接觸時間），再立即用5個柱體積以上的緩沖液A平衡。
多次使用后會有沉淀蛋白，強疏水性蛋白，脂蛋白，脂質體等非特異吸附凝膠上，可以用0.1%去垢劑短時間清洗，如0.1% Triton X-100 清洗2個柱體積，立即用結合緩沖液洗5-10個柱體積。也可以用70%乙醇清洗作同樣清洗。
4.6 填料保存
填料的初始保存液為20%乙醇，使用過后可繼續用20%乙醇保存。保存溫度在2~8℃為宜，不可凍存。
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