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更新時間：2015-12-10 
瀏覽次數：2321檢測一個基因的表達產物是否正確，或者比較表達產物量的相對變化，方法是western blot。雖然，順利的時候Western Blot做起來很簡單，可不順的時候也很令人心煩――做不出結果啦、假陽性啦、結果出現多條帶啦、到底是一抗有問題還是二抗有問題啦……畢竟，作為一種有活性的生物大分子，抗體和抗原的反應畢竟不象1+1那么明確，而用這種不確定的試劑來測定同樣知之甚少的表達產物，確實是有一定的不確定性的。所以，嚴謹的Western Blot實驗設計中要求有良好的參照體系，對實驗結果分析是非常有用的。
我們知道，要用Western Blot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達量的相對多少，前提條件是等量的細胞上樣，才有比較的基礎。特別表達量不高時，上樣量的差別就很可能影響結果的分析。艾美捷向您推薦使用內參抗體來檢測您的實驗系統，或者校準您的實驗結果。內參即是內部參照(Internal Control)，對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。在Western Blotting中使用內參其實就是在WB過程中的另外用內參對應的抗體檢測內參，這樣在檢測目的產物的同時可以檢測內參的表達，由于內參在各組織和細胞中的表達相對恒定，借助檢測每個樣品內參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結果才更為可信。此外使用內參可以作為空白對照，檢測蛋白轉膜情況是否*、整個Western Blot顯色或者發光體系是否正常。
實驗結果分析其實很簡單：如果樣品蛋白量有限，只夠進行一次電泳轉膜實驗時，分別檢測樣品的內參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內參含量，得到的數值即為內參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量，再用此數值進行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實際變化結果。如果樣品量充分，可以先檢測內參，觀測樣品間內參顯色條帶是否一致，根據差異大小調整各樣品的上樣量重新進行Western Blotting實驗，至內參量一致為止;若內參一致，即可進行不同樣品間目的蛋白表達變化分析。這樣雖然麻煩一點，但是可以保證結果更有說服力，更可信。畢竟我們的實驗是一種嚴謹的工作。
常用的細胞總蛋白質內參有GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和細胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin，這其中zui近的國外文獻報道中使用GAPDH內參的較多。對于一些植物的樣本，則需要特別的植物Actin蛋白作為內參;同樣的，如果提取的樣本是細胞核蛋白，那么PCNA或者組蛋白H3都是被經常使用的;而針對一些研究線粒體的客戶，那么Cox IV則被較多的文獻引用作為線粒體總蛋白的內部參考。
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