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更新時間：2015-08-18 
瀏覽次數(shù)：3229聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction PCR)是一種體外擴增特異性DNA片段的技術。它可以在體外特異地對目的基因進行大量擴增，其巧妙之處在預先設計合成二段分別與待測目的基因二端互補的引物，以起到指向定點的作用；再借助于DNA聚合酶催化的若干次擴增反應后，即可使特定的基因片段成百萬倍的擴增。擴增反應分三步：
①變性：當通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA。
②褪火：當溫度突然降低時由于模板分子結構較引物要復雜得多，而且反應體系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補的機會較少。
③延伸：在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物，以及Mg2+存在的條件下，
以引物為起始點，從5′→3′催化的DNA鏈延伸反應。
以上3步為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一循環(huán)的模板，若干次循環(huán)之后，介于兩個引物之間的特異性DNA片段就得到了大量的復制，數(shù)量可達2×107～8拷貝，PCR的實驗操作包括模板DNA(或RNA)的制備、引物的設計合成、酶促聚合反應、反應產(chǎn)物的檢測等。
操作步驟
模板DNA(靶序列)的制備
進行PCR擴增反應的模板可以是人體組織細胞的染色體DNA，微生物的DNA，或是由mRNA反轉錄而成的cDNA等。本實驗用小鼠肝臟制備染色體DNA作為PCR擴增的模板。
1. 取肝組織0.5g加入2ml裂解液。
2. 冰浴勻漿。
3. 取勻漿液200μl加入裂解液200μl。
4. 加入蛋白酶k至終末濃度為100μg/ml。
5. 以上溶液在65℃保溫數(shù)小時或過一夜，不時震搖。
6. 加入75μl 8M KAC，混勻。
7. 在4℃放置15分鐘。
8. 加入750μl氯仿。
9. 經(jīng)充分震搖后5 000rpm、離心5分鐘，將上清液轉入一新的Eppenderf管，沉淀棄去。
10. 加入750μl無水乙醇，充分混勻，-20℃靜置30分鐘。
11. 12 000rpm、離心10分鐘，棄去上清，沉淀用500μl 70%乙醇洗一次，10 000rpm、再離心5分鐘，棄去上清，于室溫將有DNA沉淀的Eppendorf管敞開15～30分鐘，使痕量乙醇揮發(fā)。
12. 將DNA沉淀團塊溶于100μl TE緩沖液，加RNA酶1μl，在37℃水浴放置30分鐘。
13. 用等體積的酚/氯仿抽提一次。
14. 取上清，加入1/10體積的NaAc(pH4.8)和2倍體積的無水乙醇，混勻。
15. 12 000rpm、離心10分鐘，棄去上清，沉淀用500μl 70%乙醇洗一次，10 000rpm，再離心5分鐘，棄去上清，于室溫將有DNA沉淀的Eppendorf管敞開15～30分鐘，使痕量乙醇揮發(fā)。溶于50μl TE。
16. 取1μl樣品用500μl雙蒸水稀釋，在260nm和280nm處測定吸光度。鑒定樣品純度并計算其含量。
17. 將DNA溶液保存于-20℃?zhèn)溆谩?/P>
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