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更新時間：2013-08-28 
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豬瘟抗體研究將含有編碼豬瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因的表達質(zhì)粒pETE2的重組菌轉(zhuǎn)入受體菌BL21（DE3） plysS中，經(jīng)IPTG的誘導(dǎo)，SDS-PAGE凝膠電泳分析，在約40Kda處有一特異表達的蛋白帶與預(yù)計的E2蛋白的大小基本一致；Western-blot印跡表明，該蛋白帶能與CSFV陽性血清發(fā)生特異反應(yīng)。
對大量重組菌的誘導(dǎo)表達，以包涵體的形式表達了具有抗原性的E2蛋白，收集菌體，凍融，超聲波裂解，離心收集沉淀。再分別用1M NaCl，0.5％TritonX-100，2M尿素，3M尿素，4M尿素洗滌包涵體，SDS-PAGE電泳純化E2蛋白，測定E2蛋白濃度，即為制備的基因工程抗原。
以純化的E2蛋白為抗原包被酶標板，通過對ELISA各反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定了*反應(yīng)條件：重組E2蛋白的*包被濃度為2μg／ml，zui適包被條件為4℃ 36h；*封閉液為1％BSA，封閉條件為37℃2h再加4℃12h；*血清稀釋液為0.05％Tween-20／1％BSA／2％E．coli裂解液／PBS，血清稀釋倍數(shù)為100倍，HRP-兔抗豬IgGzui適工作濃度為1：1100，*二抗稀釋液為4％PEG6000／10％NCS／PBS，二抗工作時間為20 min。 采用已確立的ELISA反應(yīng)條件，檢測了150份CSFV陰性血清（經(jīng)兔體中和試驗和間接免疫熒光證實），根據(jù)試驗結(jié)果，確定了間接ELISA方法陰陽血清的判定標準。板內(nèi)、板間檢測血清的變異系數(shù)均小于10％，對200份陰性血清的檢測結(jié)果表明本方法的特異性達95％，用建立的ELISA方法與兔體中和試驗、間接免疫熒光以及IDEXX公司的試劑盒進行比較，充分說明建立的以重組E2蛋白為抗原檢測豬瘟病毒抗體間接ELISA方法敏感性，特異性都是很好的，達到國外同類方法的水平。在此基礎(chǔ)上將成熟的ELISA技術(shù)試劑盒化，本試劑盒可操作性強，不需要配制額外試劑，3小時左右即可出結(jié)果，在4℃條件下可保存半年以上。
用組裝的試劑盒分別對新生仔豬母源抗體水平檢測，規(guī)模化豬場豬群免疫狀態(tài)的監(jiān)測，發(fā)病豬場血清檢測，基因疫苗免疫仔豬抗體水平檢測，試驗結(jié)果說明了本試劑盒能夠準確客觀地反映實際情況，進一步證明了本試劑盒的研制是成功的。
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