1、初始步驟：這是熱啟動PCR所必需的。將反應(yīng)混合物加熱至94-98度以激活DNA聚合酶。這一步驟的時間取決于所選擇的DNA聚合酶。
2、變性步驟：DNA本身是雙鏈結(jié)構(gòu)，DNA擴(kuò)增需要引物和單鏈DNA模板的結(jié)合。在該步驟中，將反應(yīng)混合物加熱至94-98℃20-30秒，以斷開雙鏈之間的氫鍵，從而釋放單鏈DNA。這是PCR周期的第一步。
3、退火步驟：變性后，DNA模板以單鏈形式存在于反應(yīng)混合物中。由于反應(yīng)系統(tǒng)中的引物與DNA模板互補(bǔ)，當(dāng)反應(yīng)溫度降至50-65度時，引物與互補(bǔ)序列形成氫鍵。
4、延伸步驟：在該步驟中，DNA聚合酶開始DNA合成，因此該步驟的溫度是DNA聚合酶的最佳溫度。我們通常選擇72度，但某些DNA聚合酶的最佳溫度是68度。這一步驟與體內(nèi)DNA復(fù)制非常相似：DNA聚合酶根據(jù)堿基互補(bǔ)的規(guī)則將dNTPs添加到引物的3'端，最終獲得新的DNA雙鏈片段。
5、步驟2至4被稱為一個周期：每個周期后的DNA量是前一個周期的兩倍。通常，PCR反應(yīng)需要30-35個周期。在前幾輪PCR循環(huán)中，PCR產(chǎn)物的數(shù)量以指數(shù)速率增加，但在反應(yīng)后期，隨著dNTPs和引物數(shù)量的減少以及DNA聚合酶的失活，反應(yīng)速率逐漸降低，因此PCR反應(yīng)的產(chǎn)率也受到限制。
6、最終延伸步驟：在30-35個循環(huán)后，我們通常在68-74度下延伸5-10分鐘，希望完成反應(yīng)系統(tǒng)中剩余的所有單鏈DNA的反應(yīng)。
更新時間：2022-11-24 
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